Пивные дрожжи с протеолитической активностью. Наименее успешным оказалось применение методов рекомбинированных ДНК для создания протеолитических дрожжевых штаммов. Известно, что для предотвращения образования мути при охлаждении и в процессе хранения существует необходимость сократить в пиве содержание полипептидов. Традиционно такая стабилизация мутности производится с использованием папаина. Ген для внеклеточной протеазы клонировали и вставляли в центромерную плазмиду [210]. Трансформация низовых дрожжей была с успехом осуществлена при селекции с использованием устойчивости к G418, однако хотя бродильные характеристики новых дрожжей оказались приемлемы, вкус полученного пива был не удовлетворительным [168]. О дальнейших работах в этой области не известно — возможно, из-за того, что внедрение в дрожжи протеолитической активности создало бы проблему в связи с гидролизом в сусле и пиве полипептидов, способствующих пенообразованию.
Модификация флокуляционных свойств пивных дрожжейФлокуляция пивных дрожжей — явление сложное, и генетика его далеко еще не ясна [166]. Показано, что к флокуляции имеет отношение ряд генов (FLOl, FL05, FL08, FLO\ 1 и tup\), но их присутствие в пивных дрожжах до сих пор является предметом научного интереса. FLO\ 1 состоит в сродстве с частью генов STA, кодирующих способность к секреции. Белковый продукт является типичным белком клеточной стенки и обнаруживается на поверхности дрожжевой клетки. Если этот ген разрушить, то флокуляции не будет [ 110]. FL08 (как и FLO 11 и STA1) выполняет контрольные функции (скорее всего, активации FLOi) [98,100]. Несущие FL08 клетки не только не флокулируют, но и не производят глюкоамилазы. FL05 гомологичен FLO 1 [8], и трансформация этим геном нефлокулирующих пивных дрожжей приводит к усилению флокуляци-онного поведения [181,182].Большинство работ по промышленным дрожжам сосредоточено на Л01 и родственных ему генах. В работе [167] исследовались 42 флокулентных дрожжевых штамма, и был сделан вывод, что эти дрожжи демонстрируют два типа флокуляцион-ного поведения. Флокуляционное поведение лагерных штаммов низового брожения и лабораторных штаммов, несущих известные гены, отвечающие за флокуляцию, явно отличалось от флокуляционного поведения штаммов дрожжей верхового брожения для производства эля. Исследования по гибридизации вначале подтвердили предполагаемое участие FLO 1 во флокуляции дрожжей низового брожения [195], но более новые данные позволили обнаружить присутствие в низовых дрожжах модифицированную версию FLO 1, обозначаемую как LgFLOi [99]. Непосредственное исследование дрожжей на пивзаводе выявило, что по мере потери при последовательных промышленных ферментациях флокуляционного поведения наблюдается деле-ция LgFLOi на дрожжевой хромосоме VIII [196].Ген FLOi был клонирован [191] и включен в последовательность, которая была вставлена в мультикопийную плазмиду и использована для трансформации нефлокулирующих дрожжей как низового, так и верхового брожения [195]. Трансформированные дрожжи оказались более флокулентными, чем их родители, но из-за кодирования этого признака на мультикопийной плазмиде новое свойство легко утрачивалось. Тем не менее брожение трансформированных дрожжей происходило удовлетворительно [192]. Тот же ген был интегрирован в геном нефлокулирующих дрожжей низового брожения [194], и модифицированные дрожжи стабильно проявляли значительно более сильную флокуляцию, чем родительский штамм. Кроме этого, ген низовых дрожжей LgFLOi был клонирован и экспрессирован в нефлокулирующих дрожжах [97]. В этом случае трансформированные дрожжи не флокулировали, пока большая часть мальтозы сусла не была сброжена (то есть перед окончанием брожения) — в противоположность дрожжам, трансформированным геном FLO 1, которые постоянно демонстрировали сильную флокуляцию. Спектр подавления флокуляции сахарами для этих двух генетических типов дрожжей также различен: флокуляция, индуцированная FLO 1, подавляется только маннозой, а флокуляция, индуцированная LgFLOi, подавляется маннозой, глюкозой, фруктозой и сахарозой. Это было непосредственно продемонстрировано путем переключения одного и того же дрожжевого штамма на функционирование или гена FLO 1, или LgFLOi [99].Существуют данные об альтернативном подходе к регулируемой экспрессии путем использования гена FLOI [186]. Ген связывали с промотором HSP30 (из гена, отвечающего за белок теплового шока), и эту генную конструкцию использовали для трансформации нефлокулирующих дрожжей. При этом экспрессия FLOi наблюдалась только тогда, когда клетки подвергали действию теплового шока. Такой подход позволяет контролировать флокуляцию дрожжей с помощью внешних стимулов, что в промышленных условиях связано с очевидными выгодами.